腺相关病毒是当前细胞基因治疗领域应用*具有潜力的载体之一,具有表达高、免疫性低、能感染非分裂细胞、安全性高等优势。该病毒自1960年代分离发现以来,经过超过半世纪的研究,作为基因递送载体将外源性基因送入人体的技术已相当成熟,在欧美范围已经有超过5种商品上市,但由于其本质上是病毒,作为药物属性的商品依然有着巨大挑战。

众所周知,病毒在生物学中同时扮演了生物和非生物的独特角色,而到了药物邻域亦然,新概念的细胞药物、病毒药物、以及外泌体这三种载体,与过去的化学药、大分子药物、小分子药物有着非常显著的差异:过去的药物讲究成分明确,像是阿司匹林的活性药物成分是乙酰水杨酸,然而新概念的药物在所谓活性药物成分上有着难以明确的困难。

以重组腺相关病毒来举例,病毒在细胞中需经历非常复杂的加工程序,才能制造出所谓的蛋白外壳来包含感兴趣基因片段,而这种"粗糙的"模拟包装程序本质上具有非常大的变异存在。举例来说,病毒外壳的转译后修饰、病毒基因组的表观遗传学、病毒包装的*度等等,这些变异意味着,即使病毒生产工艺以及病毒产品属性已经高度*化,但是本质上依然具有无法忽视的、无法检测的不*性。而这种不*性对于活性药物成分而言便是巨大挑战。

除了病毒本身因素,事实上在工艺端也有许多内在的条件仍然有待明确。例如,在摇菌工艺上,为了确切筛选克隆,我们通常会在质粒中引入抗药性基因并在培养基中加入对应的抗生素,然而成品制剂中的抗生素基因若是进入人体系统,也就意味着有发生水平基因转移的风险,这对于可能抑制免疫的接受病毒制剂的患者来说,无疑是不可忽视的高危因素。因此,如何使用不存在抗药性基因或是原核复制起始点的质粒系统,是值得注意的。

又或者是在细胞贴壁培养的培养上所使用的胎牛血清,其中内含的牛血清白蛋白是一种常用的蛋白保护剂,但是作为异体蛋白,会对患者造成过敏。牛血清白蛋白虽然在培养以及纯化中能相当大程度上去除,但是2020版《*药典》中规定的制剂牛血清白蛋白残留量(<50ng/ml或是<50ng/剂)更为严苛,因此如何达成稳定工艺对此成分去除,或是合理采用可控的血清替代物是目前临床使用重组腺相关病毒的重要先决条件。

腺相关病毒属于细小病毒科,是临床能遇到的*小病毒之一,其外壳具有60个蛋白,以三种蛋白成分以1:1:10的比例所构成,而它这种先天的空间因素便大大的限制其载量,包装过大片段则包装率降低,严重影响其产能,在此考量之下,*为合适的分子技术选择之一便是使用RNA抑制技术。透过携带有shRNA的重组病毒转导间充质干细胞,去制备具有影响病灶处细胞核酸的转基因细胞,如此可以实现高安全性、高组织选择以及趋向性、实现二次治疗的可能性、优化工艺及制造环境等优势。

图片来源:Li C, Samulski RJ. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 2020 Apr;21(4):255-272. doi: 10.1038/s41576-019-0205-4. Epub 2020 Feb 10. PMID: 32042148.